1. PCR原理
PCR是一种能够在短时间内实现将单个DNA分子扩增数百万倍的生化过程。其扩增过程包括三个连续步骤：变性， 退火， 延伸。
2. 设计引物需要考虑的参数
引物是决定PCR反应成败的最重要因素之一。
引物设计主要考虑因素为：特异性和扩增效率。
a.特异性是由错配的频率决定。特异性差的引物易产生不需要的扩增产物。
b.扩增效率是指引物以每循环增加两倍扩增产物的最优能力。
3. 计算引物的Tm值
引物用Tm值来评价DNA-DNA杂交链稳定性，过高的退火温度会导致引物-模板杂交不足，导致PCR产物产率低，而退火温度过低可能导致非特异性产物扩增。
不超过20个碱基的引物Tm值计算使用如下Wallace法则：Tm = 2℃ (A+T) + 4℃ (G+C)
超过20个碱基的引物Tm值计算可使用引物设计软件，比如Primer3。
4. 引物使用原则
PCR反应使用的引物纯化：
标准脱盐引物能满足大多数PCR应用。
PCR反应使用的引物浓度：
每种引物的PCR反应最终浓度应在0.1至0.5 μM之间。
注：过高的引物浓度会增加错配的可能，这可能导致非特异性扩增。过低的引物浓度则可能导致扩增效率低。
简并性引物对PCR扩增的影响：
通常一条引物中简并的碱基不要超过4处。
注：简并的碱基数过多，则会造成反应体系中有效引物相对的较少，应适当增加引物的使用量。但引物量过大，容易引起非特异扩增。
常用的引物设计软件推荐：primer6，beacon designer8.14，NCBI等，前两个是需要下载软件的，具体版本根据自己电脑情况选择，NCBI是网站在线使用，做生命科学实验的人一定不陌生这个网站。
BD8.14
Primer6
NCBI
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